基于ggpubr包为ggplot添加p值和显著性标记

王诗翔 · 2018-05-19

这篇文章我们将讲述

如何简单比较两组或多组的平均值
如何自动化为ggplot添加p值和显著性标记，包括箱线图、点图、条形图、线图等等

准备

安装和导入所需要的R包

需要R包ggpubr，版本>0.1.3，该包提供了基于ggplot2包的论文发表级绘图。

从CRAN安装：

install.packages("ggpubr")

或者从GitHub上下载最新的开发版本：

if(!require(devtools)) install.packages("devtools")
devtools::install_github("kassambara/ggpubr")

载入ggpubr：

library(ggpubr)
#> Loading required package: ggplot2

ggpubr的官方文档在http://www.sthda.com/english/rpkgs/ggpubr ## 样例数据集

数据：ToothGrowth数据集

data("ToothGrowth")
head(ToothGrowth)
#>    len supp dose
#> 1  4.2   VC  0.5
#> 2 11.5   VC  0.5
#> 3  7.3   VC  0.5
#> 4  5.8   VC  0.5
#> 5  6.4   VC  0.5
#> 6 10.0   VC  0.5

比较均值的方法

http://www.sthda.com/english/wiki/comparing-means-in-r包含了均值方法比较的详细描述，这里我们汇总常见的均值比较方法：

方法	R 函数	描述
T检验	t.test()	比较两组 (参数)
Wilcoxon检验	wilcox.test()	比较两组 (非参数)
ANOVA	aov() or anova()	比较多组 (参数)
Kruskal-Wallis	kruskal.test()	比较多组 (非参数)

添加p值的函数

这里我们展示ggpubr包中可以使用的用于添加p值的R函数：

compare_means()
stat_compare_means()

compare_mean()

下一部分我们将实际学习使用，这里先具体介绍一下这个函数：

compare_means(formula, data, method="wilcox.test", paired=FALSE, 
              group.by=NULL, ref.group = NULL, ...)

formula: x~group形式的公式，x是一个数值向量，group是有1个或者多个组别的因子。比如formula = TP53 ~ cancer_group。也可以使用多个响应变量，比如formula = c(TP53, PTEN) ~ cancer_group。

data: 包含变量的数据框

method: 检验的类型。默认是wilcox.test。允许的值包括：

t.test和wilcox.test。

anova和kruskal.test。

paired: 逻辑值，是否执行配对检验。仅能用于t.test和wilcox.test。

group.by: 在执行检验前对数据集进行分组的变量。指定后，会根据该变量分不同子集进行检验。

ref.group: 一个字符串，指定参考组。指定后，对于一个给定分组变量，每个分组水平都会和参考组进行比较。ref.group可以使用.all，这会对所有组别基于一个全局的均值进行两两比较。 ## stat_compare_means()

这个函数扩展了ggplot2，可以对指定ggplot图形添加均值比较的p值。

简单形式如下：

stat_compare_means(mapping = NULL, 
                   comparisons = NULL,
                   hide.ns = FALSE,
                   label = NULL,
                   label.x = NULL,
                   label.y = NULL)

mapping: 由aes()创建的映射集合

comparisons: 一个长度为2的向量列表。向量中元素都是x轴的两个名字或者2个对于感兴趣，要进行比较的整数索引

hide.ns: 逻辑值，如果TRUE，隐藏不显著标记ns

label: 指定标签类型的字符串。允许值包括p.signif（显示显著性水平），p.format（显示p值）

label.x, label.y: 数值。用于摆放标签位置的坐标，如果太短，会循环重复。

…: 其他传入compare_means()的参数，例如method,paired,ref.group

比较两个独立组别

执行检验：

compare_means(len ~ supp, data = ToothGrowth)
#> # A tibble: 1 x 8
#>   .y.   group1 group2      p p.adj p.format p.signif method  
#>   <chr> <chr>  <chr>   <dbl> <dbl> <chr>    <chr>    <chr>   
#> 1 len   OJ     VC     0.0645 0.064 0.064    ns       Wilcoxon

默认执行method="wilcox.test"，你可以指定method = "t.test"进行t检验。返回一个包含下面列的数据框：

.y: 用于检验的y变量
p: p值
p.adj: 矫正p值，默认矫正方法p.adjust.method="holm"
p.format: 格式化p值
p.signif: 显著性水平
方法：用于比较组别的统计检验

创建一个带p值的箱线图：

p <- ggboxplot(ToothGrowth, x="supp",
               y = "len", color = "supp",
               palette = "jco", add = "jitter")
# 添加p值
p + stat_compare_means()

# 改变方法
p + stat_compare_means(method = "t.test")

注意，p值标签位置可以使用label.x, label.y, hjust, vjust参数进行矫正。

默认p值标签显示是将compare_means()返回数据框的method和p列粘连到一起。你可以使用aes()函数进行组合。

比如，

aes(label = ..p.format..) 或者 aes(label = paste0("p = ", ..p.format..)): 显示p值但不显示方法
aes(label = ..p.signif..): 仅显示显著性水平
aes(label = paste0(..method.., "\n", "p =", ..p.format..)) 使用在方法和p值中插入换行符

实际操作看看：

p + stat_compare_means(aes(label = ..p.signif..),
                       label.x = 1.5, 
                       label.y = 40)

也可以使用字符串指定标签：

p + stat_compare_means(label = "p.signif", label.x = 1.5, label.y = 40)

比较两组配对样本

执行检验：

compare_means(len ~ supp, data = ToothGrowth,
              paired = TRUE)
#> # A tibble: 1 x 8
#>   .y.   group1 group2       p  p.adj p.format p.signif method  
#>   <chr> <chr>  <chr>    <dbl>  <dbl> <chr>    <chr>    <chr>   
#> 1 len   OJ     VC     0.00431 0.0043 0.0043   **       Wilcoxon

使用ggpaired()函数可视化：

ggpaired(ToothGrowth, x="supp", y="len",
         color="supp", line.color="gray",
         line.size=0.4, palette = "jco") + 
    stat_compare_means(paired = TRUE)

比较多组样本

全局检验

compare_means(len ~ dose, data = ToothGrowth,
              method = "anova")
#> # A tibble: 1 x 6
#>   .y.          p    p.adj p.format p.signif method
#>   <chr>    <dbl>    <dbl> <chr>    <chr>    <chr> 
#> 1 len   9.53e-16 9.50e-16 9.5e-16  ****     Anova

用全局p值画图：

# 默认方法为 method = "kruskal.test"
ggboxplot(ToothGrowth, x = "dose", y = "len",
          color = "dose", palette = "jco") + 
    stat_compare_means()

# 将方法改为anova
ggboxplot(ToothGrowth, x = "dose", y = "len",
          color = "dose", palette = "jco") + 
    stat_compare_means(method = "anova")

成对比较，如果分组变量包含超过两个水平，配对检验会自动执行。

# 执行成对比较
compare_means(len ~ dose, data = ToothGrowth)
#> # A tibble: 3 x 8
#>   .y.   group1 group2            p      p.adj p.format p.signif method  
#>   <chr> <chr>  <chr>         <dbl>      <dbl> <chr>    <chr>    <chr>   
#> 1 len   0.5    1      0.00000702   0.000014   7.0e-06  ****     Wilcoxon
#> 2 len   0.5    2      0.0000000841 0.00000025 8.4e-08  ****     Wilcoxon
#> 3 len   1      2      0.000177     0.00018    0.00018  ***      Wilcoxon

# 可视化： 指定你想要比较的组别
my_comparisons <- list(c("0.5","1"), c("1", "2"),
                       c("0.5", "2"))
ggboxplot(ToothGrowth, x="dose", y="len",
          color="dose", palette = "jco") +
    stat_compare_means(comparisons = my_comparisons) + #添加成对p值
    stat_compare_means(label.y = 50) # 添加全局p值
#> Warning in wilcox.test.default(c(4.2, 11.5, 7.3, 5.8, 6.4, 10, 11.2, 11.2, :
#> cannot compute exact p-value with ties
#> Warning in wilcox.test.default(c(4.2, 11.5, 7.3, 5.8, 6.4, 10, 11.2, 11.2, :
#> cannot compute exact p-value with ties
#> Warning in wilcox.test.default(c(16.5, 16.5, 15.2, 17.3, 22.5, 17.3, 13.6, :
#> cannot compute exact p-value with ties

如果你想要指定精确的y轴位置，使用label.y参数：

ggboxplot(ToothGrowth, x="dose", y="len",
          color="dose", palette = "jco") +
    stat_compare_means(comparisons = my_comparisons,
                       label.y=c(29, 35, 40)) +
    stat_compare_means(label.y = 45)
#> Warning in wilcox.test.default(c(4.2, 11.5, 7.3, 5.8, 6.4, 10, 11.2, 11.2, :
#> cannot compute exact p-value with ties
#> Warning in wilcox.test.default(c(4.2, 11.5, 7.3, 5.8, 6.4, 10, 11.2, 11.2, :
#> cannot compute exact p-value with ties
#> Warning in wilcox.test.default(c(16.5, 16.5, 15.2, 17.3, 22.5, 17.3, 13.6, :
#> cannot compute exact p-value with ties

基于参考组的多重成对比较

# 基于参考组
compare_means(len ~ dose, data = ToothGrowth,
              ref.group = "0.5", 
              method = "t.test")
#> # A tibble: 2 x 8
#>   .y.   group1 group2        p    p.adj p.format p.signif method
#>   <chr> <chr>  <chr>     <dbl>    <dbl> <chr>    <chr>    <chr> 
#> 1 len   0.5    1      1.27e- 7 1.30e- 7 1.3e-07  ****     T-test
#> 2 len   0.5    2      4.40e-14 8.80e-14 4.4e-14  ****     T-test

# 可视化
ggboxplot(ToothGrowth, x="dose", y="len",
          color="dose", palette = "jco") + 
    stat_compare_means(method="anova", label.y=40) + 
    stat_compare_means(label="p.signif", method="t.test",
                       ref.group = "0.5")

以所有值为基准(base-mean)进行多个成对比较

如果出现很多组别，两两比较过于复杂，通过将所有数据汇总创建一个虚拟的样本，以它为基准进行比较。

# Comparison of each group against base-mean
compare_means(len ~ dose,  data = ToothGrowth, ref.group = ".all.",
              method = "t.test")
#> # A tibble: 3 x 8
#>   .y.   group1 group2           p      p.adj p.format p.signif method
#>   <chr> <chr>  <chr>        <dbl>      <dbl> <chr>    <chr>    <chr> 
#> 1 len   .all.  0.5    0.000000290 0.00000087 2.9e-07  ****     T-test
#> 2 len   .all.  1      0.512       0.51       0.51     ns       T-test
#> 3 len   .all.  2      0.000000425 0.00000087 4.3e-07  ****     T-test

可视化

ggboxplot(ToothGrowth, x = "dose", y = "len",
          color = "dose", palette = "jco")+
  stat_compare_means(method = "anova", label.y = 40)+      # Add global p-value
  stat_compare_means(label = "p.signif", method = "t.test",
                     ref.group = ".all.")                  # Pairwise comparison against all

这个方法有时候会非常有用，比如下面这个例子中，我们可以通过每个样本均值与所有样本的均值进行比较，判断基因水平是过表达还是下调了。

# Load myeloma data from GitHub
myeloma <- read.delim("https://raw.githubusercontent.com/kassambara/data/master/myeloma.txt")
# 执行检验
compare_means(DEPDC1 ~ molecular_group,  data = myeloma,
              ref.group = ".all.", method = "t.test")
#> # A tibble: 7 x 8
#>   .y.    group1 group2                      p     p.adj p.format p.signif method
#>   <chr>  <chr>  <chr>                   <dbl>     <dbl> <chr>    <chr>    <chr> 
#> 1 DEPDC1 .all.  Cyclin D-1       0.288          1.00e+0 0.29     ns       T-test
#> 2 DEPDC1 .all.  Cyclin D-2       0.424          1.00e+0 0.42     ns       T-test
#> 3 DEPDC1 .all.  MMSET            0.578          1.00e+0 0.58     ns       T-test
#> 4 DEPDC1 .all.  MAF              0.254          1.00e+0 0.25     ns       T-test
#> 5 DEPDC1 .all.  Hyperdiploid     0.0000000273   1.90e-7 2.7e-08  ****     T-test
#> 6 DEPDC1 .all.  Proliferation    0.0000239      1.20e-4 2.4e-05  ****     T-test
#> 7 DEPDC1 .all.  Low bone disease 0.00000526     3.20e-5 5.3e-06  ****     T-test

可视化表达谱

ggboxplot(myeloma, x="molecular_group", y="DEPDC1",
          color="molecular_group", add="jitter",
          legend="none") + 
    rotate_x_text(angle = 45) + 
    geom_hline(yintercept = mean(myeloma$DEPDC1),
               linetype=2) + # 添加base mean的水平线
     stat_compare_means(method = "anova", label.y = 1600)+        # Add global annova p-value
  stat_compare_means(label = "p.signif", method = "t.test",
                     ref.group = ".all.")                      # Pairwise comparison against all

多个分组变量

根据某个变量分组后两个独立样本的比较

执行检验：

compare_means(len ~ supp, data = ToothGrowth,
              group.by = "dose")
#> # A tibble: 3 x 9
#>    dose .y.   group1 group2       p p.adj p.format p.signif method  
#>   <dbl> <chr> <chr>  <chr>    <dbl> <dbl> <chr>    <chr>    <chr>   
#> 1   0.5 len   OJ     VC     0.0232  0.046 0.023    *        Wilcoxon
#> 2   1   len   OJ     VC     0.00403 0.012 0.004    **       Wilcoxon
#> 3   2   len   OJ     VC     1       1     1.000    ns       Wilcoxon

因为生成了不同的子图，根据变量分面

# 根据 "dose" 变量分面绘制箱线图
p <- ggboxplot(ToothGrowth, x = "supp", y = "len",
          color = "supp", palette = "jco",
          add = "jitter",
          facet.by = "dose", short.panel.labs = FALSE)
# Use only p.format as label. Remove method name.
p + stat_compare_means(label = "p.format")

# Or use significance symbol as label
p + stat_compare_means(label =  "p.signif", label.x = 1.5)

将这几个图绘制在单个面板内：

p <- ggboxplot(ToothGrowth, x = "dose", y = "len",
          color = "supp", palette = "jco",
          add = "jitter")
p + stat_compare_means(aes(group = supp))

# 仅显示p值
p + stat_compare_means(aes(group = supp), label = "p.format")

# 使用显著性标记
p + stat_compare_means(aes(group = supp), label = "p.signif")

分组后配对样本比较

compare_means(len ~ supp, data = ToothGrowth,
              group.by = "dose", paired = TRUE)
#> # A tibble: 3 x 9
#>    dose .y.   group1 group2      p p.adj p.format p.signif method  
#>   <dbl> <chr> <chr>  <chr>   <dbl> <dbl> <chr>    <chr>    <chr>   
#> 1   0.5 len   OJ     VC     0.0330 0.066 0.033    *        Wilcoxon
#> 2   1   len   OJ     VC     0.0137 0.041 0.014    *        Wilcoxon
#> 3   2   len   OJ     VC     1      1     1.000    ns       Wilcoxon

可视化，按分组变量dose分面创建一个多面板箱线图：

p <- ggpaired(ToothGrowth, x="supp", y="len",
               color="supp", palette = "jco",
               line.color = "grey", line.size =0.4,
               facet.by = "dose", short.panel.labs = FALSE)
# Use only p.format as label. Remove method name.
p + stat_compare_means(label = "p.format", paired = TRUE)

其他图形

条形图和线图（一组变量）

# 条形图加均值标准误
ggbarplot(ToothGrowth, x = "dose", y = "len", add = "mean_se")+
  stat_compare_means() +                                         # Global p-value
  stat_compare_means(ref.group = "0.5", label = "p.signif",
                     label.y = c(22, 29))                   # compare to ref.group

# 线图加均值标准误
ggline(ToothGrowth, x = "dose", y = "len", add = "mean_se")+
  stat_compare_means() +                                         # Global p-value
  stat_compare_means(ref.group = "0.5", label = "p.signif",
                     label.y = c(22, 29))

条形图和线图（两组变量）

ggbarplot(ToothGrowth, x = "dose", y = "len", add = "mean_se",
          color = "supp", palette = "jco", 
          position = position_dodge(0.8))+
  stat_compare_means(aes(group = supp), label = "p.signif", label.y = 29)

ggline(ToothGrowth, x = "dose", y = "len", add = "mean_se",
          color = "supp", palette = "jco")+
  stat_compare_means(aes(group = supp), label = "p.signif", 
                     label.y = c(16, 25, 29))